作者：钟慧军1，刘军红2，朱永生1，彭 亮1，党 洁1，陆 宏1，焦海燕1，王燕蓉1，霍正浩1 作者单位：宁夏科技关项目(2007GG071) 1.宁夏医科大学，宁夏 银川 750004 2.宁夏大学,宁夏 银川 750021
【摘要】 目的 探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(methylene tetrahydrofolate reductase， MTHFR)基因C677T位点多态性与复发性自然流产的关系。方法 采用PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测141例复发性自然流产患者和160例有正常妊娠史的妇女MTHFRC677T基因多态性。结果 复发性自然流产患者MTHFRC677T位点三个基因型多态性与对照组有显著性差异(χ2=18.33, P<0.01);带有TT基因型的个体发生复发性流产的危险度明显增高(OR=8.44，95%CI: 2.376-30.007)。结论 MTHFR C677T纯合突变与宁夏汉族复发性自然流产相关，可能是复发性流产的遗传易感性因素。
【关键词】 复发性自然流产;亚甲基四氢叶酸还原酶;基因多态性
复发性自然流产 (repeated spontaneous abortion，RSA)病因极其复杂。研究发现，同型半胱氨酸代谢相关酶基因突变是导致叶酸代谢障碍和高同型半胱氨酸血症(hyperhomocys-teinemia，HHcy)的遗传性因素[1]，妊娠期高同型半胱氨酸(Hcy)可增加母亲血栓形成的危险性,引起胎盘血栓栓塞,从而引发流产[2-3]。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是HCY代谢途中的关键酶。本研究采用PCR-限制性片段长度多态性方法检测宁夏汉族RSA MTHFRC677T基因多态性，以探讨其与RSA的关联性。
1 材料与方法
1.1 资料来源:按知情同意原则，选择宁夏生殖与遗传重点实验室收集的有RSA史≥3次的患者141例为病例组;随机选择同期收集的经临床检查排除动静脉血栓形成、内分泌失调、染色体异常和生殖器官畸形，至少有1次以上正常分娩者160例为对照组。所有研究对象均为汉族，祖籍宁夏。采取外周静脉血5 ml，-20℃保存待提取DNA。
1.2 方法
1.2.1 主要仪器与试剂：美国BIO-RAD公司生产的Mycycler DNA扩增仪，DNA提取试剂盒由北京赛百胜基因技术有限公司提供，2×PCR Master Mix、HinfⅠ内切酶购自天根生化科技有限公司，Taq DNA聚合酶购自大连TaKaRa生物制品公司。
1.2.2 基因多态性检测：引物参照文献[4]，P1：5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’，P2：5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’。 PCR反应总体积为12μl ，含50-300 ng DNA ，引物各30 pmol， 2×PCR Master Mix 6μl，ddH2O 3.5μl。PCR扩增条件为：热启动，94℃预变性5 min; 94℃60s、60℃30s、72℃60s，循环35次;72℃延伸15min，4℃保存。用2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。限制性内切酶Hinf Ⅰ酶切扩增产物，置于37℃恒温培养箱过夜。6%聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳检测。人群中有三种基因型：CC型，酶切后仅有198 bp片断;CT型，酶切后即有198bp、175bp及23bp三个片段为杂合子突变;TT型，可产生175bp及23bp两个片段，为纯合子突变。
1.3 统计学处理：采用SPSS 10.0软件进行统计分析，计数资料采用χ2检验，基因频率采用基因计数法计算。
2 结果
2.1 基因型的确定：MTHFRC677T各基因型的确定见图1(目录后)。经PCR扩增，MTHFR基因目的片段为198bp，C→T突变的T等位基因PCR扩增产物经Hinf Ⅰ消化为175及23bp两个片段。
2.2 病例组与对照组基因型及等位基因频率分布：经计算调查人群基因型频数分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2=0.586, P>0.05)，表明具有群体代表性。MTHFR基因多态位点三种基因型在对照组和病例组之间的分布频率不同,差异有统计学意义(χ2=18.33, P<0.01)。提示，MTHFR基因位点多态性和复发性流产的发生有关。带有TT基因型的个体发生复发性流产的危险度明显增高，是CC基因型个体的8.44倍(OR=8.44，95%CI: 2.376-30.007)。病例组T等位基因频率高于C等位基因频率，差异具有显著性(χ2=19.05，P<0.01，OR=2.39，95%CI: 1.605-3.548)，见表1。表1 患者组与对照组MTHFR C677T基因型频率与等位基因频率的分布
3 讨论
血液高凝状态与RSA的形成密切相关。HHcy易造成血管内皮损伤，导致血栓形成，是近年发现的血液高凝状态形成的重要原因之一，Hcy代谢酶的基因突变引起缺陷或活性下降从而导致Hcy升高。人类的MTHFR基因位于染色体1p36.3,整个编码区长1980bp,包含11个外显子,长度从102-432bp不等,内含子250-1.5kb[4],MTHFR是在同型半胱氨酸甲基化代谢途径中起关键酶作用。目前研究发现，MTHFR基因第4外显子的C677T碱基突变最为常见,该位点突变使高度保守的丙氨酸转变成缬氨酸,使MTHFR活性降低,并产生不可耐热性,从而引起Hcy在血浆中的蓄积[3]。妊娠期高Hcy可增加母亲血栓形成的危险性,引起胎盘血栓栓塞,从而引发流产。因而，MTHFR基因多态性与复发性流产的关联性，已成为国际生殖医学领域研究的热点之一。有关MTHFR基因多态性与复发性流产的关联性研究，国内外已有不少报道，但结果不尽相同。任爱国等研究发现,中国5个群体MTHFR677C→T突变与复发性流产病危险性之间均有相关性(TT vs.CC, OR=4.32; T vs.C，OR=1.73),只有CT基因型与CC基因型比较无统计学差异[5]。本研究发现，病例组纯合突变(TT)基因型显著高于对照组，发生复发性流产的危险性明显增高，与以往国内报道的结果一致[6-8]，表明MTHFR677C→T突变可能是中国人群复发性流产的遗传易感性因素。而对荷兰、意大利、英国、以色列、美国、瑞士、德国、奥地利[5]以及印度[9]等高加索人群的分析中,均未发现MTHFR677C→T与复发性流产危险性之间存在统计学联系。可能是因为，MTHFR在我国人群的突变率较其他国家高，或许存在民族或种族之间的异质性。因此，MTHFR677位点的多态性与复发性流产危险性之间的关系尚待进一步研究。
