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中华中医药学会第十一届男科学术大会论文集
床观察指标。使中医辨证诊疗更具客观性、科学性而且对中医学发展的本身也具重要意义。
众多研究结果证实，精子DNA完整性检测的重要意义，能够反映精子遗传物质的完整性，深入的评估男
性生育力，预测治疗结局和指导治疗，在中医药诊断治疗男性不育症具有广阔的前景。
4问题与展望
众多学者在研究精子DNA完整性时都以精子DNA碎片化指数(DFI)来评估精子DNA碎片化程度与男
性生育能力、精液参数、体外辅助生殖的成功率等各方面的关系，但不同的研究者往往采用不同的DFI来
进行评估，缺乏统一的标准。目前虽然对精子DNA损伤的机制研究较多，但是还不是非常明确，以及如何
针对精子DNA的损伤进行有效的治疗等需要进一步深入研究。普遍认为精子mtDNA的突变、缺失、异常扩
增等都会造成男性不育，文献报道的位点较多，但缺乏特异性，应进一步寻找mtDAN上与男性不育的特异
性位点，揭示男性不育的机理并为临床评估男性的生育能力提供新的、特异的参考指标。虽然检测精子DNA
完整性的方法较多，但每种方法都有它的局限性，有些方法临床实际操作有一定难度并且缺乏统一的评估
标准，因此寻求一种简单易行、易于标准化的临床检测方法亟待解决。针对男性不育的不同中医证型，在
分子水平观察精子DNA的完整性，为中医诊断、治疗男性不育提供客观的理论依据。
精子DNA完整性损伤及其相关性研究进展
高永金，金保方
(南京中医药大学男科学研究所，江苏，南京，210046)
摘要：精子质量与功能下降，系目前男性不育的重要原因。虽然辅助生殖技术(Assistant reproduction
technology，ART)已使部分不育患者成功拥有了自己的后代，但ART的不良妊娠结局以及如何提高成功
率仍是亟待克服的难题。当前研究的热点主要集中在精予DNA完整性的损伤机制、精子DFI异常与男性生
育功能及辅助生殖技术妊娠结局相关性。本文就精子DNA损伤与精子DFI相关性的研究进展作简要综述。
关键词：男性不育，ART，精子DNA损伤，DFI
据统计，目前全球约有8％的育龄夫妇患有不育问题，即有5_8千万的育龄夫妇饱受不孕不育问题的
困扰，而且这个数字正以每年二百万的速度增长?，故不孕不育现已成为一个影响社会稳定和家庭幸福的
全球性问题。在众多的不孕不育影响因素中，男性因素约占40％，女性因素约占40％，双方因素约占10～
20％， 10～15％仍找不到明确原因。
虽然伴随1978年第一例试管婴儿的出生，体外受精一胚胎移植技术(invitro fertilization and
embryo transfer，IVF-ET)等ART从一定程度上解决人类的生育问题，但ART成功率偏低、术后不良妊
娠结局、各种并发症及费用偏高等不足很大程度上限制了辅助生殖技术的普及运用。同时，临床中仅仅借
助精液常规分析中的精液量、精子数量、精子存活率、活动力等指标并不足以对男性生育能力及不育原因
做出准确的判断，更不能对精子的DNA完整性、精子项体状况、精子核成熟等与精子受精及生育能力密切
相关的参数变化作出合理的解释。因此，关于精予DNA完整性损伤及精子DNA片段指数(DNA fragementation
index，DFI)的研究已经成为生殖医学领域的热点之‘‘。以下就精子DNA完整性损伤及DFI的相关研究进
展进行综述。
1．精子DNA完整性损伤
人类DNA是遗传信息的载体，对遗传物质及信息的传递起着重要的作用，在人类的繁衍及后代遗传性
状的传递中起关键性作用。与体细胞不同，人类精子染色体主要被鱼精蛋白包装，其DNA双链紧密缠绕鱼精
蛋白分子，富含半胱氨酸的鱼精蛋白通过■硫键的交联使染色质进一步浓缩，从而增加了染色体的稳定性。
而精子细胞核内的组蛋白被鱼精蛋白替代的过程发生在精子发生过程的后期，这种变化使核基质和核蛋白
结合更加紧密，从而使精子细胞核重新塑型和浓缩，对于保护精子基因组在精子面临外界应激(如女性生殖
道中的氧化作用和睾丸环境温度升高)时的完整性具有重要作用旧1。
1．1．精子DNA完整性损伤的病因
精子DNA损伤的病因，主要有环境污染、疾病、不良生活行为、微量元素及化学、物理因素等。
1．1．1环境污染
各种工业、农业或生活废弃物在降解过程，能通过水源、空气及身体接触等途径影响男性精子的
生长及生存环境。有来自美国马萨诸塞州的一项研究表明，尿邻苯二甲酸盐代谢产物单乙基邻苯二甲酸盐
与精子中DNA损伤有关呻1。高剂量的氯乙酸甲酯对精子DNA有损伤作用H1。同时，农业生产中的农药也能
损伤精子DNA，如氧化乐果对小鼠精子DNA有明显的损伤作用I?。此外，甲苯、2，4，6一三硝基甲苯及其代
谢产物、天然石炭酸均可以诱发精子DNA氧化性损伤，并导致生殖毒性埔1。各种环境射线，如手机辐射可导
致睾丸结构和功能损伤、精液参数变化、附睾精子密度降低和生育力下降等"1。
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1．1．2不良生活行为
各种不良的生活行为，如吸烟、桑拿、不洁性交、过量使用咖啡，可乐等，均可对男性的生育能力产
生严重的负面影响。研究表明长期吸烟能影响精子的DNA完整，机制可能与吸烟能使体内活性氧(Reactive
oxygen spices，ROS)增多，并通过氧化应激途径使大鼠的睾丸发生应激性的损伤随1，从而造成精子DNA
的完整性。另有文献报道，日吸烟量≥20支或吸烟年限≥10年对男性的精液量、前向运动精子比例和精
子畸形率都有影响，过量吸烟能影响精子DNA完整性和精子核的成熟旧1。吸烟、饮酒和桑拿可影响精子的
形态，特别是使无定形头精子数目增多u01。不洁性交造成的各种生殖道感染和非特异性炎症使体内活性氧
含量增多，通过氧化应激途径加剧了精子DNA损伤，可能机理是由于生殖道感染和非特异性炎症使精液中
自细胞的数量增加。此外，有报道证实，UU、CT感染可能直接影响精子形态，亦可能导致激发白细胞异常，
通过白细胞机制影响精子形态?1。
1．1．3微量元素和理化因素
人体组织内的某些微量元素参与构成了抗氧化系统。比如，精浆内足够的锌、硒元素、维生素c、E
等有抗氧化应激及抗炎的作用，能避免或减轻氧化性精子DNA损伤。有研究表明，精浆中的镉可影响精子
的质量，造成精子DNA的氧化性损伤¨引，铁毒性也会增加精子DNA损伤¨引，而硒能使人类精子细胞免受氧
化性DNA损伤。此外，肿瘤患者使用的各种化疗药物对男性生殖机能有明显的抑制作用，使精子的发生障
碍，甚至造成男性不育。
1．1．4疾病因素
生殖系统的感染性或非感染性疾病可以造成生殖管道的异常，使组织内白细胞数量增多，而过多的ROS
造成精子DNA的氧化性损伤，或通过改变精子的生长环境(如温度升高)，增加DNA的损伤。有报道证实，
在精索静脉曲张患者中，精子DNA的损伤程度远高于正常人群，且精子DNA的损伤程度与精浆ROS的浓度呈
正相关，在行精索静脉曲张高位结扎术后，精子DNA的完整性显著提高。H1。其可能机制与睾丸微循环环境
改善，一定程度上逆转了睾丸生精环境恶化所造成的生精障碍相关。
2．DNA损伤机制
精子DNA携带有男性遗传信息，通过精卵结合将父系的性状传递给子代。与体细胞不同，从精原细胞
到具有受精能力的成熟精子，经历了有丝分裂和减数分裂的复杂过程。在此过程中，精原细胞的核蛋白组
型发生了转换，即与DNA相伴随的组蛋白逐渐被鱼精蛋白所取代．而精子头部进入卵予后，精子核膜破裂，
DNA解旋，鱼精蛋白有重新被组蛋白代替，因此，精予DNA的损伤主要发生在该阶段过程中。目前，有关
精子DNA损伤的机制尚无统一的定论，主要集中在氧化应激损伤、精子DNA染色质组装异常、细胞凋亡异
常等方面。
2．1精予DNA的氧化应激损伤
随着自由基理论的建立发展，环境污染、生活不良行为以及生活方式改变所导致的ROS过多，造成精
子质膜的损伤，导致精子DNA损伤及男性不育的主要原因之一。活性氧ROS，又称为氧自由基，是指一些
具有比氧更活跃的化学反应性的氧代谢产物及其衍生的含氧的物质，主要包括超氧阴离子(02一·)、羟自
由基(0H·)、过氧化氢(H202)、单线态氧(102)及一氧化氮(N0)等。在正常情况下，男性生殖道内存在自
身的氧自由基生成与清除平衡系统，精子同样存在自身的抗氧化物及抗氧化酶类，对精子起到保护的作用。
生理情况下，人体内产生的少量ROS，能通过氧化作用，调节精子的生理功能，可为精子的顶体反应提供
能量，增加精子与透明带的结合能力。但如果ROS水平过高，超过自身抗氧化系统的清除能力，由此发生
的脂质过氧化作用及其产生的毒性产物，对精子具有毒性作用，即所谓的氧化应激(oxidative stress，
os)。
目前关于0S所致的精子损伤主要集中在：①，过量的活性氧通过精子膜脂质过氧化反应影响精子DNA
完整性。因为精子脂质膜富含多价不饱和脂肪酸，易受ROS的攻击，从而引发脂质过氧化反应，使精子脂
质膜拓扑结构遭到破坏。而精子的特殊结构使其缺少完成修复损伤所需要的胞质酶体系。因此，一旦受到
损伤，不能得到及时的修复，导致中段缺陷的精子数增高、精子活动度下降；②，精子膜的结构与其活动
功能有密切关系，ROS能影响精子膜流动性。过多的活性氧能降低精子运动能力。首先，过量的脂质过氧
化反应，造成轴丝蛋白质磷酸化程度降低和精子制动；其次，过量的ROS可能导致精子胞质内的ATP耗竭，
从而造成精子活力的下降。③，过量的ROS诱导精子DNA损伤。高水平的ROS可导致DNA单链的形成和双
链的断裂，从而影响精子DNA完整性。
2．2精子DNA染色质组装异常
精原细胞通过有丝分裂及减数分裂的复杂过程发育形成具有受精能力的精子，期间染色体经历了
明显的变化。染色体DNA结合的核蛋白也发生了从组蛋白到过渡蛋白，再从过渡蛋白到鱼精蛋白的组型转
换。该过程中，如果发生鱼精蛋白合成缺陷或功能异常，必然会发生精子染色体浓缩的异常，形成异常的
松散结构的染色质，引起精子DNA的损伤。另外，精子发生过程中，染色质的组装需要内源性核酸酶(拓扑异
构酶lI)的参与，它形成的连接缺口有利二j二鱼精蛋白替换组蛋白，其异常也可能造成DNA损伤等精子异常”?。
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精蛋白缺陷也是导致精子DNA损伤的原因之一u 6‘，精蛋白缺陷时二硫键出现异常，使其不能与DNA紧密结
合，导致染色质结构松散，双链结构不稳，出现断裂或在酸性环境下变性为单链，最终导致精子DNA损伤。
2．3精子细胞的凋亡异常
细胞凋亡是细胞的一种主动程序性死亡形式。机体通过细胞的程序性死亡来维持机体内环境的稳定，
提高抵御外来侵袭的能力。哺乳动物睾丸生精细胞在精子形成过程中的自发细胞死亡是通过生精细胞的凋
亡来实现的。正常情况下，人类睾丸生殖细胞分化前经多次有丝分裂，需要通过凋亡来控制其数量。目前
认为，精子细胞的凋亡可能是通过Fas／FasL途径来实现，生殖细胞表面表达凋亡蛋白Fas，而Sertol i细
胞表面表达Fas受体(FasL)。Sakkas等Ⅲ1发现不育男性精子表面Fas蛋白表达增加，尤其是少精子症患者，
Fas蛋白表达增加的精子数量达50％以上。这说明少精子症患者中DNA受损的精子细胞没有发生正常的凋
亡。因此，DNA异常的精子凋亡异常导致机体内正常精子数量减少，影响男性生育功能或精子正常生理功
能的发挥，进而最终导致不育。
3．精子DNA完整性损伤的检测
鉴于此，精子DNA完整性的损伤是影响男性生育能力及不育的重要原因。因此，精子DNA损伤程度的
检测在不育患者的治疗、生育能力及预后的评估中就占有极其重要的地位。目前，精子片段指数DFI，即
精子DNA断裂指数，常被用来作为衡量男性精子DNA损伤程度的客观指标，特别是在辅助生殖技术的运用
和实施过程中，DFI是其重要筛选条件。目前，针对以上精子DNA损伤机制的不同，检测方法多种多样，
也各具优缺点，尚未形成统一的检测方法和标准。在科研和临床中常用的检测方法有：彗星实验(COMET
assay)、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)、原位缺口平移法(in situ nick
translation，ISNT)、末端转移酶介导的dUTP末端标记法(terminal deoxynuc leotidyl transferase
mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)、精子染色质扩散试验(sperm chroma tin dispersion test，
SCD)、精子染色质结构分析法(spermchrom atin structure assay，SCSA)、丫啶橙试验(acridine orange
test，AOT)、8一羟基脱氧鸟苷测定(8-hydroxy一2一deoxyguanosine，8-OHdG)、单细胞凝胶电泳试验
(single—cell gelelect ropherosiS，SCGE)等。因此，由于精子DNA完整性与男性不育的关系密切，且
其病因繁多，受损机制复杂，尚未研究透彻，但仅依靠简单的精液检查难以满足现代男科学及生殖医学在
临床及科研方面的需求，故有待于一种简单易行、易于标准化的临床检测方法的早日建立。
4．DFI与男性生育功能的相关性
长期的临床诊治过程中，我们观察到，虽然某些特发性的不育症患者双方检查未发现明显的生殖机能
的障碍，但已生育或生育能力正常者精子DNA损伤程度(DFI)常较不育患者为低。各种原因所致的精子
DNA的损伤，畸形率较高的精液标本中，精子DFI指数亦较高，且精子的活动力较差。由此可见，精子DNA
完整性与男性生育能力是密切相关的。
目前，虽然人类对生育现象的解释尚达不足30％，但男性不育的多因素性及复杂性是普遍得到共识的。
近十年来，不育的相关病因机理研究较多，热点主要集中在各种原因相互作用所导致的精子DNA氧化应激
损伤。即当机体受到外界病理性因素的作用，体内ROS的生成量增加或清除能力下降，便可能进入氧化应
激状态，呈现出精子DNA断裂指数(DFI)与氧化胁迫的正性相关，而与胚胎质量和受精率呈负性相关”?。
同时，部分疾病发病过程中也可以出现精子DNA的损伤。有报道，患有精索静脉曲张(VC)的不育患者，
可表现出明显的精子DNA损伤，精液中活性氧呈现高水平状态。在对10例梗阻性无精子症或不射精患者
与10例已生育志愿者的比较发现：梗阻性无精子症或不射精患者DNA断裂指数的比例较高(均数分别为
18．9％、6．2％)n9‘。Aqarwal等晗叫报道VC患者精液中高水平ROS是导致精子畸形的重要原因之一，且患者
行静脉高位结扎术后精液ROS水平明显下降，精子活动力亦提高。
此外，文献报道，ART操作过程中，由于体外操作始终不能模拟真实的体内生理条件，多种因素都可
能导致氧化应激的产生及增加，并作用于精子、卵子、子宫内膜及胚胎等，影响胚胎着床，从而影响ART
治疗结局瞳¨。现在普遍认为乜2|，精子DFI小于27％的男性，具有正常生育能力；而大于27％的男性生育能
力低下，在ART中多表现为胚胎发育潜力低，囊胚率低，最终导致难以妊娠；另一研究发现在精子DNA损
伤率>30％的男性当中，自然生育的可能性几乎为0。因此，笔者认为精子DFI的异常与男性生育能力密切
相关，在男性不育诊治及ART的干预中对氧化应激损伤程度进行评估，具有较高的临床价值。将有利于提
高男性的生育能力及改善ART的最终结局。
5．精子DFI与ART结局的相关性
关于精子DFI与体外受精受孕率、ART结局的相关性，目前尚存在较大的争议。较多的观点认为，精
子DNA完整性或DFI与男性生育能力、精子受精能力、得胚率、胚胎质量及ART成功率呈正相关。原因在
于，自然条件下只有具有较好DNA完整性的精子才能够到达输卵管与卵子结合，女性生殖道能对精子起良
好的自然选择作用。而ART绕开了这一自然选择的过程。已有研究认为埋引，精子DNA碎片化程度与IVF和
ICSI的受精率，妊娠率呈显著负相关，精子DFI超过27％时，不会发生临床妊娠。陈泯燕等旧”采用SCD法
对242例接受IVF的男方进行精子DFI检测，将精子DFI与各项IVF结局进行相关分析后显示，精子DFI
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与IVF受精率呈负相关。Virro等嵋副研究了249对需行IVF—ET或ICSI治疗的夫妇中SCSA参数与受精、及
妊娠之间的关系，结果是在高DFI组和低DFI组，IVF和ICSI受精率没有统计学差异，而DFI大于30％的
患者无妊娠发生。因此，鉴于DFI与ART结局的正性相关性，DFI可作为ART胚胎发育的前瞻性评价标准
之一，也可为患者进周期的时机选择提供参考，同时也有助于失败原因的合理解释，从而进一步提高ART
的成功率。
另有学者则认为，精子DNA损伤可能会影响精子与卵子受精结合的过程，使囊胚形成率及种植率的显
著下降，但一旦受精完成，精子DFI并不会对胚胎质量产生明显的影响。亦认为IVF临床妊娠率与精子DNA
的损伤无明显相关性，而ICSI临床妊娠率与精子DNA损伤呈显著性正相关。较早前的动物试验证实，精
卵结合过程不依赖于精子DNA完整性，即便是DNA受损的精子仍保持一定的受精潜能，但对受精后胚胎的
发育和种植有负面影响；在体外受精中，DNA受损的精子仍能成功受精和进行正常的胚胎发育。Borini等
阻司利用TUNEL法检测IVF及ICSI患者的精子DNA损伤，结果显示精子DNA损伤与IVF及ICSI受精率并无
显著性相关。另有研究表明，当用TUNEL法评估精子DNA损伤程度时，精子DNA损伤仅显著降低了IVF临
床妊娠率，而对IVF受精率、ICSI受精率和ICSI临床妊娠率均无影响。
综上，现阶段由于男性生殖医学的实验室检查对象大多是精液，但即便是具有正常生育能力的男性精
液中也可能同时存在正常的与DNA受损的或核未成熟的精子，而这部分精子是不可能会参与受精的过程。
因此，检测结果并不能准确反映其生育能力。同时，精子DNA完整性或DFI在预测自然妊娠或ART最结局
中的价值尚存争议，目前也难以明确精子DNA损伤或精子DFI异常是否直接与妊娠失败相关。因此，有待
于检测精子DNA损伤的标准规范的早日建立。随着研究的深入，生育现象也终将得到合理的解释。
参考文献：(略)




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第32卷 第1期
2015 年 2 月
医学研究与教育
Medical Research and Education
Vol. 32 No. 1
Feb., 2015
精子DNA损伤与辅助生殖研究前景
贺丹丹1，李少鹏1，李彦2，赵晓瑞1，王泽兰1，潘潇3
（1. 河北大学临床医学院，河北 保定 071000；2. 河北大学基础医学院，河北 保定 071000；3. 河北大学护理学院，河北 保定 071000）
摘要：放化疗、吸烟、辐射、睾丸和附睾的温度变化等都会造成精子DNA不同程度的损伤。目前已有多种方法可以较好地检测精子DNA的损伤程度, 但是这些检测方法还有待完善。精子DNA损伤与育龄妇女的妊娠结局相关，为提高辅助生殖技术的成功率减少精子DNA损伤，可采用去除病因、中医药治疗、取睾丸精子行 ICSI和IMSI等方法。鉴于此，对精子DNA损伤的原因、检测方法、妊娠结局与治疗方法作一综述。
关键词：精子；DNA损伤；检测方法
DOI: 10.3969/j.issn.1674-490X.2015.01.020
中图分类号：R69 文献标志码：A 文章编号：1674-490X(2015)01-0085-07
Prospect of sperm DNA damage and assisted reproductive technology research
HE Dandan1, LI Shaopeng1, LI Yan2, ZHAO Xiaorui1, WANG Zelan1,PAN Xiao3
(1. College of Clinical Medical Science of Hebei University, Baoding 071000, China; 2. College of Basic Medical Science of Hebei University, Baoding 071000, China; 3. Nursing College of Hebei University, Baoding 071000, China)
Abstract: There are multiple factors which cause sperm DNA damage,such as radiotherapy or chemotherapy, smoking, electromagnetic radiation and temperature of the testis/epididymis. Improving the methods of sperm DNA damage detection is still necessary. A number of studies have reported that sperm DNA damage is associated with reproductive outcome. For the sake of succeeding in ART and the reducing of sperm DNA damage, some treatments are taken into consideration, such as exterminating the causes, oral antioxidant drugs, traditional Chinese medicine and ICSI /IMSI with testis sperm. This review focuses on the mechanism and detection of sperm DNA damage, it’s association with reproductive outcomes, and relevant treatment strategies in assisted reproductive technology.
Key words: sperm; DNA damage; methods of sperm DNA damage detection
随着辅助生殖技术的逐步发展，精子DNA损伤导致男性不育的问题越来越受到医学研究者的关注。当前研究表明，放化疗、吸烟、辐射、睾丸和附睾的温度升高等都在不同程度上对精子DNA造成损伤。目前已经有多种检测精子DNA完整性的方法，如彗星实验、精子染色质结构分析法、原位标记法等，但这些方法仍待改善。鉴于精子DNA损伤对妊娠结局有很大影响，现广大医学研究者已提出去除病
收稿日期：2014-11-11
作者简介：贺丹丹（1992—），女，河北张家口人。E-mail: 18730217918@163.com
本文引用：贺丹丹, 李少鹏, 李彦, 等.精子DNA损伤与辅助生殖研究前景[J]. 医学研究与教育, 2015, 32(1): 85-91.
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第1期
第32卷
医学研究与教育
因、中医药治疗、取睾丸精子行卵浆内单精子注射（ICSI）和卵浆内形态选择后单精子注射（IMSI）等方法对精子DNA损伤进行治疗。本文就对精子DNA损伤的原因、检测方法、妊娠结局与治疗方法作一综述。
1 精子DNA损伤的主要原因
1.1 吸烟
Linschooten等[1]研究发现，吸烟会减少精子的产生，增加氧化应激、DNA损伤和脂质过氧化水平。Soares等[2]认为，吸烟导致精子的受精能力以及胚胎种植成功率降低。Jensen等[3]认为，长期接触烟草会减少成熟精子的数量。Calogero等[4]使用香烟烟雾的提取成分在试管内进行实验，研究显示，该提取物抑制精子的运动性，并且使线粒体膜电位较低的精子数量增加。另外，香烟烟雾提取成分对精子染色质的凝固和凋亡都有不利影响，还能诱导精子对于浓度和时间的依赖性，增加精子磷脂酰丝氨酸外化（一种早期凋亡的信号）和DNA碎片化（晚期凋亡的标志）的数量。
1.2 睾丸温度升高
所有关于精液分析的课本和实验指南都在强调射出精液的温度的重要性，应尽量保持精液在运送到实验室时其温度与体温相近，Mortimer等[5]建议应尽可能在37 ℃的条件下射精，以确保精液高效液化。Makler等[6] 研究发现，精液中的精子暴露在高温环境中大大降低了能动性、活力和生存率，暴露在低温环境，例如在4 ℃时，会降低精子的能动性，但其活力不会明显下降。
精子也存在一种冷休克现象，这是由于精子质膜磷脂的不可逆改变和离子失衡导致酶活性降低，尤其是过多负载钙离子的精子。脂质可以有序的凝胶状态或有序程度较低的流体状态(更灵活)存在。这些状态之间的转化发生在特定的温度范围之内，也与细胞膜特定的脂肪酸组成相关，后者决定了为什么“冷休克”对某些生物(例如野猪)精子的影响大于对其他生物(例如牛)精子的影响。Sieme等[7]研究发现，大多数哺乳动物细胞膜的熔点在0～15 ℃，但是细胞膜完全溶化不能突然发生，所以温度的改变可以导致细胞膜脂质的凝胶状态和流体状态同时存在，进而细胞膜发生构象改变，引起功能变化。由于上述原因，用于任何类型研究的精液样本，不论是在运往实验室过程中，还是在处理分析和临床应用的过程中，都必须保护精液免受超出生理范围的温度影响。
加热可以对精子的发生和形成产生巨大影响。Brindley [8]早在1982年就提出紧身内裤会提高睾丸温度并且导致不孕，因此，冷却睾丸可能会恢复生育能力。
1.3 辐射
人类早就认识到接触X线对睾丸有很大的损伤，即使是相对较少的X线也能引起男性不育，其主要原因是精上皮对这类辐射极度敏感，导致精子的发生和成熟过程完全崩溃。Rowley等[9]实验发现，X线剂量低至1～6 Gy仍可导致人类精子数量减少，若剂量达到15 Gy（用于治疗男性睾丸原位癌的剂量）则可引起精子缺乏症。但是Singh等[10]研究发现，强度在0～2 Gy范围内，X线强度越高，精子DNA碎片化就越严重。
早在30年前Makler等[11]就发表了高频无线电波对人体有害的学说，2008年Agarwal等[12]证实，移动手机发出的电磁辐射对人体也有一定的损害。2012年Avendan.o等[13]研究发现，无线网会影响精子的结构特征。De Iuliis等[14]认为，无线电波对精子损害的病理生理基础在于电磁辐射会增加线粒体的氧化过程，进而降低精子的运动性和活力，刺激DNA加合物的形成，最终导致DNA碎片化加重。因此，
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第1期
2015年
贺丹丹等：精子DNA损伤与辅助生殖研究前景
高频无线电波对男性生育能力的影响需要引起人类的高度重视。
1.4 放疗和化疗
为提高肿瘤患者的生存率，放疗和化疗被广泛应用于临床工作中，并成为重要治疗手段。但是，一些重大的不良反应也随之而来，尤其对精液参数较差和患有严重精子DNA损伤的睾丸肿瘤和淋巴瘤的年轻男性患者影响很大。对肿瘤进行特意性治疗时，放、化疗会将快速增殖的睾丸生精上皮细胞作为天然靶细胞，使其受到严重损伤。放疗、化疗对于生精上皮的损伤相似，损伤后生精功能恢复大致需要几个月到几年不等，但是精子DNA损伤的存在时间要远远长于生精功能恢复的时间。所以，众多专家建议年轻男性肿瘤患者在结束放化疗12～24个月以后再考虑受孕，若将要进行放、化疗，可冻存适量健康精子，以便随时受孕。
2 精子DNA损伤的主要检测方法
2.1 精子染色质结构分析法（SCSA）
1980年Evenson等[15]提出用吖啶橙的染色异质性区分伴有DNA损伤的精子与正常精子，此方法称为精子染色质结构分析法（SCSA）。正常精子DNA稳定的双链结构具有抗酸功能，有利于维持精子DNA的完整性。而损伤精子的鱼精蛋白中的巯基没有被氧化，其染色质结构变得松散，易受酸性物质影响成为单链DNA。本方法中的吖啶橙与正常DNA结合后，仍以单体形式呈现并发出绿色荧光，与单链DNA结合则形成聚合物形式并呈现黄色或者红色荧光[16]。流式细胞仪可以检测精子DNA发出的荧光，计算机利用这些荧光处理后得到的SCSA参数(DNA片段指数和高DNA可染性)来评估精子DNA的完整性。近些年，此方法已成为检验精子完整性的金标准。就临床预测价值而言, SCSA可以获得最有价值的临床数据并且提供可用的临床指南。
2.2 彗星实验
彗星实验也就是单细胞凝胶电泳实验（SCGE)。Ostling和Johanson[17]首次提出SCGE方法，并由Singh完善此方法来更好地检测精子DNA损伤。SCGE主要通过检测DNA单链和双链的断裂，该机制为：将精子悬液与琼脂糖混均匀平铺在玻片上，凝固后精子DNA溶解并且解链成功，之后进行电泳。精子DNA损伤使DNA超螺旋结构松散，负电荷暴露，电泳时损伤的精子DNA向阳极移动，形成“彗星”的尾部，而未损伤的精子DNA会向阴极移动形成“彗星”头部[18]。洗涤玻片后在显微镜下观察用荧光染料染色的DNA，通过研究相应的参数来分析精子DNA损伤的结果。其中彗星的头尾长度可评估精子DNA损伤的程度，用于细胞毒理学研究。Cordelli等[19]2007年报道了关于改良彗星实验“牛精子彗星实验”作为生殖细胞基因毒性测试方法的内容，该方法以从海拉细胞中获得的蛋白质提取物为基础，在显微幻灯下对牛精子创造新的酶切位点，这样就可以检测在精子DNA加合物修复过程中的DNA断裂。
2.3 原位标记法
原位标记有两种方法，分别是末端转移酶介导的脱氧三磷酸鸟苷末端标记法（TUNEL）和原位缺口平移法。TUNEL法常被用来确定细胞凋亡,也可以用来检测精子DNA碎片。通常使用流式细胞仪对其结果进行分析，也可以使用光学显微镜和荧光显微镜来评估精子DNA损伤程度。TUNEL是用异硫氰荧光素（FITC）[20]作标记物由末端转移酶催化的反应；原位缺口平移法是用生物素或者地高辛作标记物，由DNA聚合酶Ⅰ催化的反应。断裂的精子DNA在上述两种酶的催化下将FITC-dNTP连接在断裂DNA的末端，用流式细胞仪、光镜或者荧光显微镜计数伴有DNA损伤的精子数量。
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第 1 期 医 学 研 究 与 教 育 第32 卷
2.4 精子染色质扩散试验（SCD）
2003年Fernández等[21]提出SCD。先制作精子悬液，与琼脂糖均匀混合后平铺在玻片上，用酸溶液处理后去除核蛋白，并使用DAPI或Diff-Quik试剂染色，最后用荧光显微镜观察[22]。有完整DNA的精子经过以上步骤后DNA扩散形成特征性的光晕，而伴有损伤的精子DNA不会产生光晕或光晕很小。2005年SCD经过改善后制成了Halosperm试剂盒，由于保持了精子尾部的完整性，使用光学显微镜即可观察结果，很好地判断精子DNA损伤程度。
3 精子DNA损伤与辅助生殖技术结局
3.1 精子DNA损伤与妊娠结局
3.1.1 精子DNA碎片化与反复流产（RSA）
反复流产（RSA）指的是连续3次或3次以上的妊娠失败。精子DNA损伤程度与自然受孕率显著相关，当精子DNA损伤率（DFI）>30%时，自然受孕率几乎达到零。Carrell等[22]采用TUNEL方法分别对RSA患者丈夫、生育男性以及随机抽样男性的精子DNA的损伤程度进行测定，研究结果表明，RSA患者的丈夫精子DNA损伤的程度显著高于另外两组,并且还应用荧光原位杂交技术（FISH法）测定了三组实验对象精子染色体的非整倍性，结果RSA患者丈夫的精子染色体非整倍性也显著高于另外两组[23]。Carrell等[22]认为，男性精子DNA损伤和精子染色体非整倍性均会影响胚胎的发育分裂和种植，从而导致RSA发生。
3.1.2 精子DNA损伤与宫腔内人工受精（IUI）的结局
IUI现已被广泛应用于男性不育症的临床治疗，成功率高达15%~20%。但是精子DNA损伤仍是影响IUI成功率的重要因素之一。研究[23]表明，DFI>30%时，IUI成功率非常低。对于进行IUI反复失败的患者应该及时行ICSI或ICMI治疗[24]。
3.1.3 体外受精（IVF）和ICSI
体外受精逾越了对精子DNA完整性筛选的这个过程，使得采用SCSA方法检测DFI＞30％仍能受精成功。Moeeis等[25]认为，精子DNA损伤程度与行体外受精的妊娠率呈负相关。Bungum等[24]在2004年对IVF和ICSI的妊娠结局进行了研究。结果显示当DFI>27％时，ICSI的妊娠结局明显好于IVF，因此建议对于伴有精子DNA损伤的患者行ICSI助孕。但是Ahmadi等[26]认为，精子DNA损伤并不会影响受精的完成，但会导致囊胚形成率降低，最终导致胚胎种植和妊娠的失败率增高。Borini等[27]研究证实了Ahmadi的观点，该研究采用TUNEL法检测行IVF和ICSI治疗的患者精子DNA损伤的程度，结果表明精子DNA严重损伤的患者囊胚形成率、种植率和妊娠率均显著降低。
3.2 精子DNA损伤对后代的影响
体外受精尤其是单精子注射技术使得伴有DNA损伤的精子成功受精，但同时也将一些遗传缺陷带给后代。Hansen等[28]研究发现，通过辅助生殖技术出生的婴儿伴有重大畸形的概率远高于自然出生的婴儿。Jackson等[29]对多项相关研究进行系统分析，结果发现IVF后代与自然妊娠的后代相比，围生期死亡、早产和低出生体重的风险均增高。.rstavik等[30]对ICSI出生的婴儿进行染色体分析，研究表明，ICSI出生的婴儿患强直性脊柱炎的风险明显高于自然妊娠的婴儿。Fernández-Gonzalez等[31]研究发现，精子DNA损伤也会增加后代患癌症以及减短后代寿命的风险。
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第 1 期 2015 年
贺丹丹等：精子DNA损伤与辅助生殖研究前景
4 精子DNA损伤的治疗对策
4.1 去除病因
由于多种病因可引起精子DNA损伤，解除病因应是有效的治疗方法之一。首先应改善生活习惯，避免长时间驾驶、高温沐浴等，另外戒烟和远离生活污染物可降低毒性物质对精子DNA的损害[32]。精索静脉曲张患者，可结扎精索静脉或进行其他有效治疗；生殖道感染，应尽快进行抗感染治疗，降低精浆活性氧（ROS）的含量；对于想要晚育的男性或即将进行放化疗的肿瘤男性患者，可先行精子欲冻存，以便以后随时受孕，且不会导致精子DNA出现严重损伤。
4.2 中医药治疗
中医药对男性精子DNA损伤的治疗有其独特的疗效。金保方等[33]发现，应用适量活血补肾养精的中药胶囊，并配合补锌补硒的中药，可以提高精子DNA的完整性，减轻精子DNA损伤。同年，金保方等[34]应用“加味水陆二仙丹”为主药的中药方成功治愈1例右侧精原细胞瘤手术后因放疗引起的无精症，并用ICSI使其配偶受孕成功，进一步证明中医药可降低精子DNA损伤的程度。
4.3 ICSI与IMSI
睾丸精子DNA损伤程度很大程度上轻于精液中的精子，机制可能是精子DNA损伤发生在睾丸后。Greco等[35]检测并对比18例ICSI治疗连续失败的男性患者射出的精子与睾丸精子，发现射出精子DNA的损伤程度明显高于睾丸精子DNA。采用精子DNA损伤程度较轻的睾丸精子替代精液中精子对行ICSI反复失败的患者再次行ICSI治疗，胚胎种植率以及其配偶的妊娠率都大幅度提高。更重要的是，应用此方法改进ICSI后，出生的婴儿伴有重大畸形的概率也显著降低。近几年，众多研究表明IMSI也可有效降低精子DNA的损伤程度，帮助提高妊娠率，降低畸胎率。随着研究的进一步发展，IMSI很可能会代替ICSI成为治疗精子DNA损伤而导致的男性不育的主要方法。
5 结语
精子DNA损伤对男性不孕与辅助生殖技术在临床上有重要的意义。目前寻找一种更简易、更易于标准化的精子DNA损伤的检测方法尤为重要。去掉致病因素、药物治疗等都能在一定程度上改善精子DNA损伤的程度，有助于降低ICSI和IMSI后代伴有重大畸形的风险。相信随着医学技术的发展与医学实验的进一步研究，许多关于精子DNA损伤的问题会更明朗，精子DNA损伤的测定也会更好地在临床上为男性不育的诊疗提供帮助。
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（责任编辑：刘俊华）
贺丹丹等：精子DNA损伤与辅助生殖研究前景






复旦大学
博士学位论文
环境和遗传因素导致男性不育分子机制的相关研究
姓名：牛志宏
申请学位级别：博士
专业：妇产科学
指导教师：张慧琴
2010-04-15
复旦大学医学院博士毕业论文
中文摘要
有性生殖中，胚胎的形成始于精卵结合。由于哺乳动物精卵细胞体积的悬殊
及精子发生、成熟过程中特有的形态及细胞成分的变化，长久以来广泛认为在受
精及胚胎早期发育过程中，精子仅仅提供受精所需的雄性来源DNA。随着近年对
精子生殖功能的深入探索，已有迹象表明精子DNA和RNA在男性生育功能方面
可能存在同样重要的调控作用。为研究精子DNA和RNA对男性生育功能及其进
行辅助生育技术的影响，进行了下列研究：
应用精子染色质结构完整性检i贝!j(SCSA)的方法检测育龄男性精子DNA损伤，
指标分别为DNA碎片指数(DFI)和高DNA着色性(HDS)，探讨吸烟对育龄男性精
子质量，尤其是精子DNA损伤的影响。该研究发现吸烟920支／日和吸烟年限≥10
年的患者组精液量、前向运动精子比例低于且精子畸形率显著增高(尸吸烟组与非吸烟组相比， 平均DFI(II．6±8．9％VS 9．3±8．4％)和HDS值
(13．6±11．2 VS 7．8±9．1％)均有上升(KO．05)。提示吸烟≥20支／日和吸烟年
限≥lO对精子DNA完整性和核成熟度有不良影响。
比较精子DNA不同损伤程度对各项辅助生育技术治疗结局的影响。将DFI正常
阈值设为≤27％，HDS正常阈值设为≤15％。按以下标准分别分组比较，组1为DFI
≤27％且HDS≤15％，组2为DFI>27％且liDS≤15％，组3为DFI≤27％且HDS>15％，组4
为DFI>27％且HDS>15％。IUI治疗周期中，与组I相比，组2和组3患者妊娠率有降
低趋势，但各组比较妊娠结局未达到统计学意义；ROC(受试者工作曲线)显示
DFI>20．6％或HDS>35．5％时，进行IUI治疗获得妊娠的可能性<5％。
精子DFI>27％的男性进行IVF助孕时，受精率、可用胚胎率和新鲜周期移植
后妊娠率没有明显降低，但优质胚胎率明显下降；其day3的胚胎碎片程度增加。
精子HDS>15％的男性进行ICSI助孕时，受精率低于正常组男性，但其可用胚胎率、
优质胚胎率及新鲜周期移植后妊娠率没有明显降低。三种方式中精子DFI和lIDS
指标同时异常者均未获得妊娠，提示DFI和HDS联合指标对男性生育力的预测价值
可能更大。
通过对人精子RT—PCR的研究表明，精子细胞特异表达的新基因hssp41 l在
男性精子mRNA中存在多态性，两种异构体在不同男性精子中的表达存在差异，
约有90％的男性精子mRNA中有异构体5的表达：仅有i0％的男性基因异构体5缺
复旦大学医学院博士毕业论文
失表达：两种异构体在同一男性精子中的表达量也存在差异，异构体5占主导，其
mRNA表达量大大高于异构体4；hssp41 1基因组体外重组表达研究发现，尽管
hssp41 1 mRNA有两种异构体存在，但最后的蛋白表达仅有一种(异构体5的表
达产物)，因此精子mRNA中是否有异构体5的表达可能是男性不育的一个分子标
志，可为男性不育的病因诊断提供新的思路。
原发性纤毛运动障碍(primary ciliary dyskinesia，PCD)是一种基因突变
造成的纤毛运动障碍性疾病。患者精液表现无或极少活动精子，须借助ICSI技
术获得后代，但其受精率很不稳定。我们通过透射电镜诊断7例PCD男性，均存
在纤毛超微结构异常；通过热点基因测序，寻找突变位点，发现5例PCD患者在
编码外动力臂的DNAH5基因中存在相同的突变位点248315G—C，这是国内外尚
未报道的；对8个ICSI周期的妊娠结局和精子质膜完整性及精子来源的相关性
进行分析。
4个周期使用自然射精，3个周期使用TESA精子，还有1个周期同时采用自然
射精和TESA精子进行授精。8个周期总共获得成熟的MII'卵子73枚，平均受精率为
46．6％(34／73)。所有ICSI周期都获得了至少1枚可用胚，但只有5个周期有优质
胚胎，其中有3个周期获得了临床妊娠。因此，我们认为，ICSI是目前治疗PCD
伴男性不育患者的唯一有效的方法且PCD患者精子质膜完整性可能与其ICSI治疗
结局相关，精子质膜完整性检测可以实现对PCD,患者的初筛，有可能发展成为PCD
患者精子质量评价的常规方法，用来预测PCD患者ICSI治疗的成功率。
关键词：DNA：损伤，辅助生育技术，宫腔内人工授精，体外受精，单精子胞
浆内显微注射，基因表达，原发性纤毛运动障碍
4
复旦大学医学院博士毕业论文

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